{"id":"bgbl1-1976-135-3","kind":"bgbl1","year":1976,"number":135,"date":"1976-11-20T00:00:00Z","url":"https://offenegesetze.de/veroeffentlichung/bgbl1/1976/135#page=4","api_url":"https://api.offenegesetze.de/v1/veroeffentlichung/bgbl1-1976-135-3/","document_url":"https://media.offenegesetze.de/bgbl1/1976/bgbl1_1976_135.pdf#page=4","order":3,"title":"Verordnung zur Änderung der Verordnung über Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln und Vormischungen","law_date":"1976-11-12T00:00:00Z","page":3176,"pdf_page":4,"num_pages":10,"content":["3176                   Bundesgesetzblatt, Jahrgang 1976, Teil I\nVerordnung\nzur Änderung der Verordnung über Analysemethoden\nfür die amtliche Untersuchung von Futtermitteln und Vormischungen\nVom 12. November 1976\nAuf Grund des § 18 Abs. 1 Nr. 1 des Futtermittel-\ngesetzes vom 2. Juli 1975 (Bundesgesetzbl. I S. 1745)\nwird mit Zustimmung des Bundesrates verordnet:\nArtikel 1\nDie Verordnung über Analysemethoden für die\namtliche Untersuchung von Futtermitteln und Vor-\nmischungen vom 12. November 1975 (Bundesgesetz-\nblatt I S. 2859) wird wie folgt geändert:\n1. In § 1 Nr. 1 wird vor der Zeile „Alkaloiden in\nLupinen\" die Zeile „Aflatoxin Bi\" eingefügt.\n2. In der Anlage werden nach den Allgemeinen\nBestimmungen die Beschreibungen der Analyse-\nmethoden für Aflatoxin Bi eingefügt, die sich\naus der Anlage zu dieser Verordnung ergeben.\nArtikel 2\nDiese Verordnung gilt nach § 14 des Dritten\nDberleitungsgesetzes vom 4. Januar 1952 (Bundes-\ngesetzbl. I S. 1) in Verbindung mit § 24 des Futter-\nmittelgesetzes auch im Land Berlin.\nArtikel 3\nDiese Verordnung tritt am Tage nach der Verkün-\ndung in Kraft.\nBonn, den 12. November 1976\nDer Bundesminister\nfür Ernährung, Landwirtschaft und Forsten\nIn Vertretung\nRohr","Nr. 135--Tag der Ausgabe: Bo1!-n, den 20. November 1976                     3177\nAnlage\nAflatoxin B1\nA. Methode mit eindimensionaler Dünnschichtchromatographie\n1. Zweck und Anwendungsbereich\nDie Methode dient der Bestimmung des Gehaltes an Aflatoxin Bi in Erdnuß-, Kokos-, Lein-,\nSoja-, Sesam-, Babassu- und Maiskeimkuchen, Getreide und Getreideerzeugnissen, Erbsenmehl,\ngetrockneter Kartoffelschlempe und Kartoffelstärke. Die untere Grenze der Bestimmbarkeit\nbeträgt 0,01 mg/kg.\nWenn Störsubstanzen die Auswertung erschweren, muß die Analyse nach der Methode B mit\nzweidimensionaler Dünnschichtchromatographie wiederholt werden.\n2. Prinzip\nDie Probe wird mit Chloroform extrahiert. Der Extrakt wird filtriert und ein aliquoter Teil\ndurch Chromatographie an einer Kieselgelsäule gereinigt. Das Eluat wird eingedampft und der\nRückstand in einer definierten Menge Chloroform oder Benzol-Acetonitrilgemisch gelöst. Ein\naliquoter Teil dieser Lösung wird dünnschichtchromatographisch untersucht. Die Aflatoxin-fü-\nMenge wird im UV-Licht visuell oder fluorodensitometrisch im Vergleich zu bekannten Mengen\nAflatoxin-Bi-Standard ermittelt. Die Identität von Aflatoxin B1 im Futtermittelextrakt muß\ndurch die angegebenen Verfahren bestätigt werden.\n3. Reagenzien\n3.1    Aceton, p. a.\n3.2    Chloroform, p. a., mit 0,5 bis 1,00/o (GIG) Äthanol 960/o (V/V) stabilisiert\n3.3    n-Hexan, p. a.\n3.4    Methanol, p. a.\n3.5    Diäthyläther, p. a., wasserfrei, peroxidfrei\n3.6    Gemisch von Benzol, p. a. / Acetonitril, p. a., 98 : 2 (V/V)\n3.7    Mischung aus Chloroform (3.2) und Methanol (3.4) 97 : 3 (V /V)\n3.8    Kieselgel für Säulenchromatographie, 0,05 bis 0,20 mm Teilchengröße\n3.9    Watte, hydrophil und mit Chloroform entfettet, oder Glaswolle\n3.10   Natriumsulfat, p. a., wasserfrei, gekörnt\n3.11   Inertgas, z.B. Stickstoff\n3.12    1 N-Salzsäure\n3.13   Schwefelsäure 500/o (V/V), p. a.\n3.14   Kieselgur (Hyflosupercel), mit Säure gewaschen\n3.15   Kieselgel G-HR oder gleichwertiges für Dünnschichtchromatographie\n3.16   Standardlösung mit etwa 0, 1 µg Aflatoxin Bi je ml in Chloroform (3.2) oder in Benzol-\nAcetonitrilgemisch (3.6), hergestellt und kontrolliert nach Nummer 7\n3.17    Qualitative Standardlösung mit etwa 0, 1 /tg Aflatoxin Bi und fü je ml in Chloroform\n(3.2) oder Benzol-Acetonitrilgemisch (3.6). Diese Konzentrationen sind als Anhaltspunkte\nzu betrachten. Sie sind, entsprechend dem unterschiedlichen Fluoreszenzvermögen, so z1;1\nwählen, daß sich für beide Aflatoxine dieselbe Fluoreszenzintensität ergibt.","3178                               Bundesgesetzblatt, Jahrgang 1976, Teil I\n3.18   Fließmittel:\n3.18.1 Mischung aus Chloroform (3.2) und Aceton (3.1) 9 : 1 (V /V), Trennkammer mit nicht ge-\nsättigter Atmosphäre\n3.18.2 Mischung aus Diäthyläther (3.5), Methanol (3.4) und Wasser 96: 3: 1 (V/V/V), Trenn-\nkc1mmer mit nicht gesättigter Atmosphäre\n3.18.3 Mischung aus Diäthyläther (3.5), Methanol (3.4) und Wasser 94 : 4,5 : 1,5 (V /V /V), Trenn-\nkc1mmer mit gesättigter Atmosphäre\n3.18.4 Mischung aus Chloroform (3.2) und Methanol (3.4) 94: 6 (V/V), Trennkammer mit ge-\nsättigter Atmosphäre\n3.18.5 Mischung· aus Chloroform (3.2) und Methanol (3.4) 97: 3 (V/V), Trennkammer mit ge-\nsättigter Atmosphäre (identisch mit Nummer 3.7).\n4. Geräte\n4.1    Mahl- oder Mischgerät\n4.2    Schüttelmaschine oder Magnetrührer\n4.3    Faltenfilter, Schleicher & Schüll Nr. 588 oder gleichwertige Filter, Durchmesser 24 cm\n4.4    Chromatogrnphierohr aus Glas (innerer Durchmesser 22 mm, Länge 300 mm), mit Teflon-\nhahn und 250-ml-Vorratsbehälter\n4.5    Vacuumrotationsverdampfer mit 500-ml-Rundkolben\n4.6    500-ml-Erlenmeyerkolben mit Schliffstopfen\n4.7    Ausrüstung für Dünnschichtchromatographie\n4.8    Glasplatten für Dünnschichtchromatographie, 200 X 200 mm, die wie folgt (die angege-\nbenen Mengen reichen für fünf Platten) vorbereitet werden: 30 g Kieselgel G-HR (3.15)\nwerden in einem Erlenmeyerkolben mit 60 ml Wasser versetzt, der Kolben wird ver-\nschlossen und eine Minute geschüttelt.\nDie Suspension wird in einer einheitlichen Schichtdicke von 0,25 mm auf die Platten\naufgetragen. Diese läßt man an der Luft trocknen und bewahrt sie dann im Exsikkator\nüber Kieselgel als Trocknungsmittel auf. Vor Verwendung werden sie eine Stunde im\nTrockenschrank bei 110 °C aktiviert.\nFertigplatten können verwendet werden, sofern sie einen ähnlichen Trenneffekt ergeben,\nwie die in der oben beschriebenen Weise hergestellten.\n4.9    Analyselampe für langwelligen UV-Bereich (360 nm). Die Lichtintensität muß ausreichen,\num einen Aflatoxin-Bi-Fleck von 1,0 ng auf einer Dünnschichtplatte in 10 cm Entfernung\nvon der Lampe noch deutlich zu erkennen-.\n4.10   10-ml-Reagenzgläser, graduiert, mit Schliff und Polyäthylenstopfen\n4.11   UV-Spektralphotometer\n4.12   Fluorodensitometer (wahlweise).\n5. Ausführung\n5.1    Vorbereitung der Probe\nDie Probe wird gemahlen, so daß sie vollständig durch ein 1-mm-Sieb (entsprechend der\nISO-Empfehlung R 565) hindurchgeht.\n5.2    Extraktion\n50,0 g der gemahlenen und homogenisierten Probe werden in einen 500-ml-Erlenmeyer-\nkolben (4.6) eingewogen und 25 g Kieselgur (3.14), 25 ml Wasser und 250 ml Chloroform\n(3.2) hinzugefügt. Nach Schließen des Kolbens wird 30 Minuten mit dem Gerät (4.2) ge-\nschüttelt bzw. gerührt. Anschließend filtriert man durch ein Falterfilter (4.3). Die ersten\n10 mJ des Filtrats werden verworfen, die nächsten 50 ml aufgefangen.\n5.3    Säulenchromatographische Reinigung\nDas untere Ende des Chromatographierohrs (4.4) wird mit einem Watte- oder Glaswolle-\npfropfen (3.9) versehen, das Rohr zu etwa zwei Dritteln mit Chloroform (3.2) gefüllt.\nDann werden 5 g Natriumsulfat (3.10) hinzugefügt, wobei darauf zu achten ist, daß die","Nr. 135 --Tag der Ausgabe: Bonn, den 20. November 1976                       3179\nNatriumsulfatschicht eine ebene Fläche bildet. Anschließend gibt man 10 g Kieselgel (3.8)\nin kleinen Portionen hinzu. Nach jeder Zugabe ist vorsichtig zu rühren, um Luftblasen\nzu entfernen. Man läßt das Kieselgel 15 Minuten absetzen und fügt dann vorsichtig 15 g\nNatriumsulfat (3.10) hinzu. Dann läßt man die Flüssigkeit bis unmittelbar an die Ober-\nfläche des Natriumsulfats ablaufen.\n50 ml des nach 5.2 erhaltenen Filtrats werden mit 100 ml n-Hexan (3.3) gemischt. Man\ngibt die Mischung quantitativ auf die Säule und läßt die Flüssigkeit bis zur Oberfläche\ndes Natriumsulfats einsickern. Anschließend fügt man 100 ml Diäthyläther (3.5) hinzu\nund läßt die Flüssigkeit wieder bis zur Oberfläche des Natriumsulfats einsickern. Die\nDurchflußgeschwindigkeit soll 8 bis 12 ml/Minute betragen, ein Trockenlaufen der Säule\nist zu vermeiden. Der Durchlauf wird verworfen. Danach wird mit 150 ml Chloroform-\nMethanolgemisch (3.7) eluiert, wobei das gesamte Eluat aufgefangen wird.\nDas Eluat wird im Vakuumrotationsverdampfer (4.5) bei einer Temperatur des Bades\nvon weniger als 50 °C unter einem inerten Gasstrom (3.11) bis fast zur Trockne ein-\ngedampft. Der Rückstand wird mit Chloroform (3.2) oder Benzol-Acetonitrilgemisch (3.6}\nquantitativ in ein 10-ml-Reagenzglas (4.10) übergeführt, die Lösung im inerten Gas-\nstrom (3.11) eingeengt und anschließend mit Chloroform (3.2) oder Benzol-Acetonitril-\ngemisch (3.6) auf ein Volumen von 2,0 ml aufgefüllt.\n5.4   Dünnschichtchromatographie\nAuf einer Dünnschichtplatte (4.8) werden 2 cm vom unteren Rand entfernt nebeneinander\nim Abstand von 2 cm mit Hilfe einer Kapillarpipette oder einer Mikroliterspritze fol-\ngende Mengen der Standardlösung und des Extraktes punktförmig aufgetragen:\n10, 15, 20, 30 und 40 µl der Aflatoxin-Bi-Standardlösung (3.16);\n10 1,d des nach 5.3 gewonnenen Extraktes und 20 td der Standardlösung (3.16) überein-\nander auf denselben Punkt;\n10 und 20 pJ des nach 5.3 gewonnenen Extraktes.\nDie Platte wird, vor Licht geschützt, mit einem der Fließmittel (3.18) entwickelt. Zur Aus-\nwahl eines geeigneten Fließmittels trägt man vorher 25 µl der qualitativen Standard-\nlösung (3.17) auf eine der Platten auf und prüft, ob bei der Entwicklung eine vollständige\nTrennung der Aflatoxine Bi und fü erreicht wird.\nMan läßt das Fließmittel im Dunkeln verdampfen und betrachtet dann die Platte im\nUV-Licht in 10 cm Abstand von der Lampe (4.9). Die Flecke von Aflatoxin Bi weisen\neine blaue Fluoreszenz auf.\n5.5   Quantitative Bestimmung\nDie Bestimmung ist entweder visuell oder durch Fluorodensitometrie wie folgt vorzu-\nnehmen:\n5.5.1 Visuelle Bestimmung\nDie im Extrakt enthaltene Menge Aflatoxin Bi wird durch Vergleich der Floureszenz-\nintensität der Flecke des Extraktes mit derjenigen der Flecke der Standardlösung be-\nstimmt. Falls erforderlich, ist zu interpolieren. Die durch Ubereinanderauftragen von\nExtrakt und Standardlösung erzielte Floureszenzintensität muß stärker sein als die von\n10 µl des Extraktes, und es darf nur ein einziger Fleck erkennbar sein. Ist die Fluo-\nreszenzintensität von 10 µI des Extraktes stärker als die von 40 µl der Standardlösung,\nso ist der Extrakt auf das 10- oder 100fache mit Cp.loroform (3.2) oder Benzol-Acetonitril-\ngemisch (3.6) zu verdünnen und erneut in der beschriebenen Weise auf eine Dünnschicht-\nplatte aufzutragen.\n5.5.2 Fluorodensitometrische Messung\nDie Fluoreszenzintensität der Aflatoxin-Bi-Flecke wird mit Hilfe des Fluorodensitometers\n(4.12) bei 443 nm gemessen bei einer Anregung mit 365 nm. Durch Vergleich der Fluo-\nreszenzintensitäten der Extraktflecke mit denen der Standardflecke bestimmt man die\nin den Extraktflecken enthaltene Menge von Aflatoxin Bi.\n5.6   Identifizierung von Aflatoxin Bi\nAflatoxin Bi wird im Extrakt wie folgt identifiziert:\n5.6.1 Behandlung mit Schwefelsäure\nDas nach 5.4 erhaltene Chromatogramm wird mit Schwefelsäure (3.13) besprüht. Die\nFloureszenz der Aflatoxin-Bi-Flecke muß im UV-Licht von blau nach gelb umschlagen.\n5.6.2 Zweidimensionale Chromatographie mit Bildung von Aflatoxin-Bi-hemiacetal (Afla-\ntoxin Bia)","3180                              Bundesgesetzblatt, Jahrgang 1976, Teil 1\nNachstehende Arbeitsgänge sind nach folgender Skizze durchzuführen:\nI\n•\nI[\n(Maße in cm)\n5.6.2.1 Auftragen der Lösungen\nIn eine Platte (4.8) werden, parallel zu zwei angrenzenden Seiten, und zwar jeweils\n6 cm vom Rand entfernt, zwei gerade Linien als Begrenzung für die Lösungsmittelfron-\nten geritzt. Auf die Platte trägt man mit Hilfe einer Kapillarpipette oder einer Mikro-\nliterspritze folgende Lösungen auf:\nBei Punkt A: Ein Volumen des nach 5.3 erhaltenen gereinigten Probenextraktes, das\netwa 2,5 ng Aflatoxin Bi enthält,\nbei Punkt B und C: Jeweils 25 p l der Standardlösung (3.16).\n5.6.2.2 Entwicklung\nDas Chromatogramm wird mit dem Fließmittel (3.18.1) (1-cm-Schicht in einer Trenn-\nkammer mit nicht gesättigter Atmosphäre) im Dunkeln in Richtung I entwickelt, bis die\nLösungsmittelfront die Begrenzungslinie erreicht. Danach nimmt man die Platte aus der\nTrennkammer und läßt sie im Dunkeln fünf Minuten bei Raumtemperatur trocknen.\nWährend man den Rest der Platte mit einer Glasscheibe abdeckt, besprüht man einen\n2,5 cm breiten Str~ifen (schraffierte Fläche in der Abbildung), der die Punkte A und B\nüberdeckt, mit Salzsäure (3.12), bis eine Dunkelfärbung auftritt. Man läßt 10 Minuten im\nDunkeln reagieren und trocknet die Platte dann in einem Luftstrom bei Raumtemperatur.\nAnschließend entwickelt man das Chromatogramm mit dem Fließmittel (3.18.1) (1-cm-\nSchidlt in einer Trennkammer mit ungesättigter Atmosphäre) in Richtung II, bis die\nLösungsmittelfront die Begrenzungslinie erreicht. Nach Entnahme der Platte aus der\nTrennkammer läßt man sie bei Raumtemperatur trocknen.\n5.6.2.3 Interpretation des Chromatogramms\nDas Chromatogramm wird unter UV-Licht (4.9) auf folgende Merkmale geprüft:\nVorhandensein eines blau fluoreszierenden Fleckes von Aflatoxin Bi, der von der bei C\naufgetragenen Standardlösung stammt und in Richtung I gewandert ist;\nVorhandensein eines blau fluoreszierenden Fleckes von Aflatoxin Bi (nicht mit Salz-\nsäure umgesetzt) und eines intensiven blau fluoreszierenden Fleckes von Aflatoxin-B1-\nhemiacetal, die beide von der bei B aufgetragenen Standardlösung stammen und in\nRichtung II gewandert sind;","Nr. 135 - - Tüg der Ausgabe: Bonn, den 20. November 1976                3181\nVorhundt~nsei~ ähnlicher Flecke, wie zuvor beschrieben, die von dem bei A aufgetrage-\nnen Probenextrakt stammen; die Lage dieser Flecke ergibt sich erstens aus der Lauf-\nstrecke des Aflatoxins fü von Punkt A in Richtung I (dieselbe Strecke, die der bei C\naufgetragene Standard zurückgelegt hat) und zweitens aus den Laufstrecken des nicht\numgesetzten Aflatoxins Bi und des Aflatoxin-Bi-hemiacetals von dort in Richtung II\n(dieselben Strecken, die von dem bei B aufgetragenen Standard zurückgelegt wurden).\nDie Fluoreszenzintensitäten der beiden, von dem Extrakt und der bei B aufgetragenen\nStandardlösung stammenden Halbacetalflecke sollten dabei einander entsprechen.\n6. Be r e c h nun g der Ergebnisse\n6.1      Visuelle Messung\nDer Aflatoxin-B1-Gehalt der Probe in µglkg wird nach folgender Formel berechnet:\nS·Y·V\nW·X\nHierbei sind:\nY und X\"-•-\" Mengen, in µl, der Aflatoxin-Bi-Standardlösung (3.16) bzw. des Extraktes,\nderen Fluoreszenzintensität identisch ist,\nS           :=,. Konzentration in µg Aflatoxin Bi je ml der Standardlösung (3.16),\nV                Endvolumen des Extraktes in µl, unter Berücksichtigung etwaiger Verdün-\nnung,\nW           ==   Gewicht der Probe in g, bezogen auf die für die säulenchromatographische\nReinigung verwendete Extraktmenge.\n6.2      Messungen durch Fluorodensitometrie\nDer Gehalt der Probe an Aflatoxin Bi in µglkg wird nach folgender Formel berechnet:\nS·V\nW·Y\nHierbei sind:\nY  :=    Volumen des auf die Platte aufgetragenen Extraktes in µl (10 oder 20 µl),\nS = Aflatoxin-Bi-Gehalt des Extraktfleckes in ng, den man aus der Messung erhält\n(bezogen auf das angewandte Volumen Y),\nV  =---= Endvolumen des Extraktes in µl, unter Berücksichtigung etwaiger Verdünnung,\nW        Gewicht der Probe in g, bezogen auf die für die säulenchromatographische Reini-\ngung verwendete Extraktmenge.\n7. Herstellung und Kontrolle der Standardlösung (3.16)\n7.1      Bestimmung der Aflatoxin-Bi-Konzentration\nEine Aflatoxin-Bi-Standardlösung wird in Chloroform (3.2) oder Benzol-Acetonitril-\ngemisch (3.6) mit einer Konzentration von 8 bis 10 µg pro ml hergestellt. Das Absorp-\ntionsspektrum wird zwischen 330 und 370 nm mit einem Spektralphotometer (4.11)\ngemessen.\nDie Extinktion (A) ist im Fall einer Chloroformlösung bei 363 nm, im Fall einer Lösung\nin Benzol-Acetonitrilgemisch bei 348 nm, zu messen.\nDie Aflatoxin-B1-Konzentration in µg/ml Lösung wird nach folgenden Formeln berechnet:\n312 ·A · 1 000\nbei der Chloroformlösung;\n20 600\n312 ·A · 1 000\nbei der Lösung im Benzol-Acetonitrilgemisch.\n19 800\nDie zur Herstellung einer Standardarbeitslösung mit einer Aflatoxin-Bi-Konzentration\nvon etwa 0,1 µ.g/ml erforderlichen Verdünnungen werden im Dunkeln vorgenommen.\nDie Lösung ist, bei 4 °C im Kühlschrank aufbewahrt, zwei Wochen haltbar.\n7.2      Kontrolle der chromatographischen Reinheit\nAuf einer Dünnschichtplatte (4.8) werden 5 µl der Aflatoxin-Bi-Standardlösung, die\n8-- 10 p.g Aflatoxin Bi pro ml enthält (siehe 7.1) aufgetragen. Das Chromatogramm wird\nnach 5.4 entwickelt. Im UV-Licht darf nur ein einziger Fleck erkennbar sein; außerdem\ndarf an der Stelle der ursprünglichen Auftragung keine Fluoreszenz wahrnehmbar sein.","3182                                   Bundesgesetzblatt, Jahrgang 1976, Teil I\n8. W i e tl er h o 1 b a r k e i t\nDer Unterschied zwischen den Ergebnissen            zweier Parallelbestimmungen eines Analytikers\nsollte in derselben Probe bei Gehalten von\n10 bis 20 p,g/kg Aflatoxin B1                      25 °/o des höheren Resultats,\nmehr als 20 bis 50 p.g/kg Aflatoxin Bt              5 µglkg absolut,\nmehr als 50 11g/kg A flatoxin Bi                   10 °/o des höheren Resultats\nnicht überschreiten.\n9. Bemerkungen\n9.1      Entfettung\nProben mit mehr als 5 °/o Fett sind im Anschluß an die unter Nummer 5.1 beschriebene\nVorbereitung mit Petroläther (Kp 40- 60 °C) zu entfetten. In diesem Fall sind die Ergeb-\nnisse auf das Gewicht der nicht entfetteten Originalprobe zu beziehen.\n9.2      Vergleichbarkeit der Ergebnisse\nDie Ergebnisse zweier oder mehrerer Untersuchungsstellen bei Proben aus derselben\nSammelprobe gelten noch als vergleichbar, wenn die Abweichungen höchstens betragen:\n± 50 °/o des Mittelwertes der Ergebnisse bei Mittelwerten an Aflatoxin Bi von 10 bis\n20 t,tglkg,\n± lO p.g/kg vom Mittelwert bei Mittelwerten an Aflatoxin Bi von mehr als 20 bis\n50 p.glkg,\n± 20 °/o des Mittelwertes bei Mittelwerten an Aflatoxin Bi von mehr als 50 1ig/kg.\nB. Methode mit zweidimensionaler Dünnschichtchromatographie\n1. Zweck und Anwendungsbereich\nDie Methode erlaubt die Bestimmung des Gehaltes an Aflatoxin Bi in Futtermitteln, sofern\ndiese nicht unter den Anwendungsbereich der Methode A fallen. Die untere Grenze der Be-\nstimmbarkeit beträgt 0,01 mg/kg. Die Methode ist nicht anwendbar bei Futtermitteln, die\nCitrus-Trester enthalten.\n2. Prinzip\nDie Probe wird mit Chloroform extrahiert. Der Extrakt wird filtriert und ein aliquoter Teil\ndurch Chromatographie an einer Kieselgelsäure gereinigt. Das Eluat wird eingedampft und der\nRückstand in einer definierten Menge Chloroform oder Benzol-Acetonitrilgemisch gelöst. Ein\naliquoter Teil dieser Lösung wird der zweidimensionalen Dünnschichtchromatographie unter-\nworfen. Die Aflatoxin-Bi-Menge wird im UV-Licht visuell oder fluorodensitometrisch im Ver-\ngleich zu bekannten Mengen Aflatoxin-B1-Standard ermittelt. Die Identität von Aflatoxin Bi\nim Futtermittelextrakt muß durch das angegebene Verfahren bestätigt werden.\n3. Reagenzien\n3.1      Aceton, p. a.\n3.2      Chloroform, p. a., mit 0,5 bis 1,0 °/o (GIG) Äthanol 96 °/o (V /V) stabilisiert\n3.3      n-Hexan, p. a.\n3.4      Methanol, p. a.\n3.5      Diäthyläther, p. a., wasserfrei, peroxidfrei\n3.6      Gemisch von Benzol, p. a./ Acetonitril, p. a., 98 : 2 (V/V)\n3.7      Mischung aus Chloroform (3.2) und Methanol (3.4) 97 : 3 (V/V)\n3.8      Kieselgel für Säulenchromatographie, 0,05 bis 0,20 mm Teilchengröße\n3.9      Watte, hydrophil und mit Chloroform entfettet, oder Glaswolle\n3.10     Natriumsulfat, p. a., wasserfrei, gekörnt\n3.11     Inertgas, z. B. Stickstoff\n3.12     1 N-Salzsäure\n3.13     Kieselgur (Hyflosupercel), mit Säure gewaschen\n3.14     Kieselgel G-HR oder gleichwertiges für Dünnschichtchromatographie\n3.15     Fließmittel:\n3.15.1 Mischung aus Diäthyläther (3.5), Methanol (3.4) und Wasser 94: 4,5: 1,5 (V/V/V), Trenn-\nkammer mit gesättigter Atmosphäre,","Nr. 135--Tag der Ausgabe: Bonn, den 20. November 1976                     3183\n3.15.2 Mischung aus Chloroform (3.2) und Aceton (3.1) 9: 1 (V/V), Trennkammer mit nicht\ngesättigter Atmosphäre,\n3.16   Standardlösung mit etwa 0,1 µg Aflatoxin Bi pro ml in Chloroform (3.2) oder in Benzol-\nAcetonitrilgemisch (3.6), hergestellt und kontrolliert nach Nummer 7 der Methode A.\n4. Geräte\nSiehe unter Nummer 4 der Methode A.\n5. Ausführung\n5.1    Vorbereitung der Probe\nSiehe unter Nummer 5.1 der Methode A\n5.2    Extraktion\nSiehe unter Nummer 5.2 der Methode A\n5.3    Säulenchromatographische Reinigung\nSiehe unter Nummer 5.3 der Methode A\n5.4    Zweidimensionale Dünnschichtchromatographie\n5.4.1  Auftragen der Lösungen (Durchführung nach folgender Skizze 1)\nIn eine Platte (4.8) werden parallel zu zwei benachbarten Seiten, und zwar in einem\nAbstand von 5 und 6 cm von der jeweiligen Kante, zwei gerade Linien als Begrenzung\nfür die Lösungsmittelfronten geritzt. Auf die Platte werden mit Hilfe einer Kapillar-\npipette oder einer Mikroliterspritze folgende Lösungen aufgetragen:\nBei Punkt A: 20 µI des nach 5.3 erhaltenen gereinigten Probenextraktes\nbei Punkt B: 20 pJ der Standardlösung (3.16)\nbei Punkt C: l 0 1,d der Standardlösung (3.16)\nbei Punkt D: 20 µl der Standardlösung (3..16)\nbei Punkt E: 40 µl der Standardlösung (3.16)\nMan trocknet in einem schwachen Strom von lnertgas (3.11). Die erhaltenen Flecke soll-\nten einen Durchmesser von etwa 5 mm aufweisen.\nSkizze 1\nlI\n•\ni\n1\nJe\n1\nCD\nyo     Standards\ntC\n1\nl\n1\n1\n1\n1                                                           I\n1\n-\nN\n1\n1\n1\nStandard\nIA                                               ... - -\n-1- ------- -· - -                                   B\n•\ni--\n1\n• 2 ........._______ 13\n------------•----\n(Maße in cm)\ns  -+-",":-:H84                           Bundesgesetzblatt, Jahrgang 1976, Teil I\n5.4.2 Entwicklung (siehe Skizze 1)\nDas Chrornatogramm wird mit dem Fließmittel (3]5.1) (1-cm-Schicht in einer Trenn-\nkarrnner mit gesättigter Atmosphäre) im Dunkeln in Richtung I entwickelt, bis die\nLösungsmittelfront die Begrenzungslinie erreicht hat. Danach nimmt man die Platte aus\nder Trennkammer und läßt sie 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln trocknen.\nAnschließend entwickelt man das Chromatogramm unter Verwendung des Fließmittels\n(3.15.2) (1-cm-Schicht in einer Trennkammer mit nicht gesättigter Atmosphäre) im Dun-\nkeln in Richtung II, bis die Lösungsmittelfront die Begrenzungslinie erreicht hat. Dann\nentfernt man die Platte aus der Trennkammer und läßt sie bei Raumtemperatur im Dun-\nh~ln trocknen.\n5.4.3 Auswertung des Chromatogramms (Durchführung nach folgender Skizze 2)\nMan betrachtet das Chromatogramm unter UV-Licht, wobei die Platte 10 cm von der\nLampe (4.9) entfernt sein soll, und bestimmt die Lage der von den Standardlösungen\nstammenden blau fluoreszierenden Flecke B, C, D und E von Aflatoxin Bi. Senkrecht zur\njeweiligen Laufrichtung werden durch diese Punkte zwei gedachte Geraden gezogen.\nDer Schnittpunkt P dieser Geraden ergibt den Ort, an dem der aus dem bei A (Skizze 1)\naufgetragenen Probenextrakt stammende Aflatoxin-Bi-Fleck zu erwarten ist. Tatsächlich\nfindet sich der Aflatoxin-Bi-Fleck jedoch meist beim Punkt Q, dem Schnittpunkt zweier\ngedachten Geraden, die einen Winkel von etwa 100° bilden und durch die Punkte B bzw.\nC gehen. Man bestimmt die im Probenextrakt enthaltene Menge Aflatoxin Bi wie unter\n5.5 beschrieben.\nSkizze 2\nJI\n,,e\n'\nStandards \\• o\n,c\n1\\\n1\\\n1\\\n1 \\                                  I.\n1 \\\n1 \\\n-1r   1\n-fJ!9o~    -   -   ...,\n8\nStandard\n__\n5.4.4 Ergänzende Chromatographie (siehe Skizze 1)\nIn eine neue Platte (4.8) ritzt man parallel zu zwei benachbarten Seiten zwei gerade\nLinien und trägt auf Punkt A übereinander 20 µl des nach 5.3 erhaltenen gereinigten\nProbenextraktes und 20 !,tl Standardlösung (3.16) auf. Man entwickelt das Chromato-\ngramm wie unter 5.4.2 beschrieben. Im UV-Licht (4.9) wird geprüft, ob\nsich die Aflatoxin-Bi-Flecke von Extrakt und Standardlösung überlagern und\ndie Fluoreszenz dieses Fleckes eine höhere Intensität aufweist, als der Aflatoxin-Bi-Fleck\nbei Punkt Q der ersten Platte.\n5.5   Quantitative Bestimmung\nDie Bestimmung ist entweder visuell oder durch Fluorodensitometrie wie folgt vor-\nzunehmen:","Nr. 135   Tag der Ausgabe: Bonn, den 20. November 1976                         3185\n5.5.1  Visuelle Bestimmung\nDie im Extrakt enthaltene Menge Aflatoxin Bi wird durch Vergleich der Fluoreszenz-\nintensität des vom Extrakt stammenden Fleckes mit derjenigen der Flecke C, D und E\nder Standardlösung bestimmt. Falls erforderlich, ist zu interpolieren. Ist die Fluoreszenz-\nintensität von 20 ,ul Extrakt stärker als die von 40 µl Standardlösung, so ist der Extrakt\nauf das 10- oder 100fache mit Chloroform (3.2) oder Benzol-Acetonitrilgemisch (3.6) zu\nverdünnen und erneut in der beschriebenen Weise auf eine Dünnschichtplatte aufzu-\ntragen.\n5.5.2  Fluorodensitometrische Messung\nDie Fluoreszenzintensität der Aflatoxin-Bi-Flecke wird mit Hilfe des Fluorodensitometers\n(4.12) bei 443 nm gemessen bei einer Anregung mit 365 nm. Die Aflatoxinmenge ergibt\nsich aus dem Vergleich der Fluoreszenzintensität des Probenfleckes mit derjenigen der\nStandardflecke C, D und E.\n5.6    Identifizierung von Aflatoxin Bi\nSiehe unter Nummer 5.6 der Methode A.\n6. Berechnung der Ergebnisse\nSiehe unter Nummer 6 der Methode A.\n7. Wiederholbarkeit\nSiehe unter Nummer 8 der Methode A.\n8. Bemerkungen\nSiehe unter Nummer 9 der Methode A."]}